詳談RNA提取試劑在rna提取中的作用

氯仿是分子量比較大的有機(jī)溶劑，在提取rna時(shí)，氯仿可以有效的使有機(jī)相和無機(jī)相迅速分離。rna提取過程，有機(jī)相中主要是酚和蛋白結(jié)合，從而使得蛋白和rna脫離，rna進(jìn)入水相。
氯仿的作用有多個(gè)方面，加入氯仿，雖然有變性蛋白質(zhì)的作用，但是其主要用處是用來分相，實(shí)際上是加速有機(jī)相和水相的分層。一般的RNA提取試劑TrizolReagent在4度下是油狀懸浮液，提高溫度，放置一段時(shí)間，自然也會(huì)分相。離心后混合物分成三層：下層苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。rna無一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為400ul?！緲?biāo)準(zhǔn)：1mltrizol加200ul的氯仿，水樣層的容量大約為所加trizol 容量的60% 】
上層水相，ph 5.1左右，當(dāng)溶液ph在酸性的時(shí)候，rna分子就會(huì)沉淀在酚與溶液的界面，只有rna分子留在水相。而當(dāng)ph接近中性時(shí)，rna就會(huì)溶解在水相，（導(dǎo)致ph中性的大概原因是trizol與樣品比例不對(duì)，應(yīng)該盡量保證提取量的前提下使trizol過量）trizol法提rna，加氯仿就是要?jiǎng)×艺鹗幉判?，這樣才能*地兩相混勻。
異丙醇的作用是通過-oh的疏水作用使得rna鏈中的親水基團(tuán)受到保護(hù)，等同于沉淀，但是這是個(gè)反應(yīng)時(shí)發(fā)生在水相中，與前面的氯仿不矛盾。通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀rna， rna沉淀在離心前通常不可見，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。
異丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一樣。只不過用量少一點(diǎn)，0.6v——1v就夠了，在水相很多，離心管容積有限，加不下太多乙醇的時(shí)候一般會(huì)用異丙醇沉淀。不過感覺效果不如乙醇，偶爾會(huì)有沉淀不出來東西的時(shí)候?！?00ul的水相對(duì)應(yīng)500ul的的異丙醇?！?/div>
醇沉淀是很經(jīng)常用的方法，因?yàn)閞na和某些雜質(zhì)不溶于異丙醇，所以可以用來沉淀。乙醇沉淀的主要目的是沉淀+除鹽。
RNA提取試劑TrizolReagent主要物質(zhì)是異硫氰酸胍，它可以破壞細(xì)胞使rna釋放出來的同時(shí)，保護(hù)rna的完整性 。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。rna存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，rna 可以通過異丙醇沉淀來還原。
無論是人、動(dòng)物、植物還是細(xì)菌組織，trizol法對(duì)少量的組織(50-100 mg)和細(xì)胞(5×106)以及大量的組織(≥1 g)和細(xì)胞(>;107)均有較好的分離效果。RNA提取試劑TrizolReagent操作上的簡(jiǎn)單性允許同時(shí)處理多個(gè)的樣品。所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。trizol抽提的總rna能夠避免dna和蛋白的污染。故而能夠作rna 印跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(a)+ 選擇、體外翻譯、rna酶保護(hù)分析和分子克隆。 提取時(shí)需要注意一些問題：提取時(shí)要做到超凈臺(tái)內(nèi)操作、操作帶一次性手套、ep管及tip頭都要用0.1%處理（0.1%depc浸泡過夜后，高壓蒸氣滅菌）、小心、細(xì)致、晃動(dòng)及每次移液要輕。這樣做的*目的就是兩個(gè)，一是小心rnase的污染降解rna；二是動(dòng)作過度暴力破壞rna的完整性。
另外你提的rna做電泳的問題，一般rna電泳應(yīng)該是做甲醛變性電泳，但是一般的瓊脂糖電泳也可以，需要上樣量稍微大些，并且跑電泳的時(shí)間越短越好。